Se partió de un cultivo base de C. vulgaris al que se le añadió fertilizante foliar [14]. Luego se siguió la técnica aséptica descrita por Malajovich [15], y como fuente de luz se empleó una cinta LED roja (figura 1, icono 2) de 14,4 W, con longitud de onda 600-680 nm [15] y un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad [16], controladas con un temporizador Completel TS-WU3 (figura 1, icono 3). Para la agitación se usaron bombas de aire Shark RS-610 (figura 1, icono 4), con un caudal de 4 L/min, conectadas directamente a cada recipiente de vidrio de 250 mL (figura 1, icono 5), por medio de mangueras de 1/16 de plástico. El recipiente también tenía una manguera de salida, para desgasificar (figura 1, icono 6).

Figura 1

Fig. 1

Los diferentes tipos de subproductos provenientes de procesos industriales o agrícolas se compararon mediante una matriz de selección, con los criterios de relación de porcentaje de nitrógeno a costo, susceptibilidad a contaminación y disponibilidad. El primer criterio se refiere a la cantidad de nitrógeno en porcentaje teórico de cada fuente que puede aportar al medio de cultivo [14], dividido entre el costo por gramo de cada una en el mercado.

Este criterio se evaluó definiendo tres rangos de relación: bajo, de 0 a 0,3; medio, de 0,3 a 5, y alto, mayor a 5. La susceptibilidad a la contaminación se tomó en cuenta, dado que no todas las fuentes tienen la misma carga de microrganismos, materia orgánica y contenido de agua; por ello, se evaluó este criterio para determinar si es necesario realizar algún pretratamiento a dichas fuentes. En la evaluación del criterio de disponibilidad se buscaron fuentes de fácil adquisición en Bogotá (zona de realización del ensayo experimental), para evitar costos adicionales de transporte y que no compitieran con la alimentación humana.

Después de seleccionar tres fuentes orgánicas potenciales para el cultivo, se determinaron las concentraciones de experimentación.

No se encontró información sobre el uso de la harina de sangre ni de la de soya; pero sí del suero de la leche [12]. En la literatura sobre el tema [12], [13], [17] se consultaron los valores de la proteína bruta en el suero lácteo, la harina de sangre y la harina de soya (7 %, 10 % y 7,04 %), y ya que esta es una medida indirecta de la cantidad de nitrógeno, con el factor mostrado en la ecuación 1 se realizaron las conversiones de proteína bruta a nitrógeno.

N_total = Proteína bruta / 6,25 (1)

Este factor se basa en la suposición de que aproximadamente un 16 % de nitrógeno está presente en la proteína promedio [18].

Para el seguimiento a los cultivos se utilizó el método de recuento celular en la cámara de Neubauer [16], [19] y se halló la concentración celular por medio de la ecuación 2.

= #𝐶é𝑙.𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗ 𝐹𝐷 ∗ 50.000 (2)

FD es el factor de dilución. Para evaluar la cinética de crecimiento, se usó la ecuación 3, según la cual el incremento celular por unidad de tiempo es proporcional al número de células en el cultivo, y la constante de proporcionalidad es la tasa de crecimiento (µ) [17], [19], [20].

dN/dt = µN (3)

Con las concentraciones celulares se graficaron las curvas de crecimiento, que, linealizadas, permitieron determinar las tasas intrínsecas de crecimiento de la microalga en cada medio, gracias a la ecuación 4.

Ln N = Ln No+ µt (4)

Donde N es el número de células al cabo del tiempo t y N _o es el número inicial de células [21].

Los cultivos microalgales se enriquecieron [14] con la fuente orgánica e inorgánica de nitrógeno a concentraciones definidas previamente. Después de ello se compararon con un ensayo experimental de control, con fertilizante foliar. Los parámetros de evaluación fueron: peso seco, rendimiento de la biomasa, productividad volumétrica y fracción proteica. El volumen total de trabajo en los experimentos fue de 3 L.

Se evaluó la influencia de la concentración de suero lácteo y de la concentración del NaNO₃, mediante análisis de varianza (Anova) de un factor, para determinar si afectaban significativamente la tasa intrínseca de crecimiento en los cultivos, con un nivel de significancia, α = 0,1.

Se empleó el protocolo basado en: métodos y herramientas analíticas en la evaluación de la biomasa microalgal [22]. Las muestras se secaron en un horno marca Nabertherm-TR120, variando su temperatura gradualmente hasta 50 °C durante 18 h para muestras de 50 mL. Después, se llevaron las muestras a un desecador por 3 h y se pesaron en una balanza analítica de 5 dígitos hasta peso constante.

Por último, se determinó el peso seco mediante la ecuación 5, y la productividad volumétrica, mediante la ecuación 6.

PST = (PSFM-PSF) / VF (5)

Donde PST es el peso seco total, PSFM y PSF son los pesos del filtro con muestra y del filtro sin muestra, respectivamente, y VF es el volumen de muestra filtrado.

Productividad = PST / Vc∙t (6)

Donde PST es el peso seco de la biomasa, Vc es el volumen total de cultivo y t es el tiempo de cultivo en días.

Previo al envío para análisis, la muestra se secó en un horno Challenger GH/DOR 120V/E, a 100 °C durante 12 h para muestras de 280 mL. Se dispuso de 0,53 g de biomasa seca de cada uno de los tratamientos para enviar a análisis de cuantificación de proteínas por el método Kjeldahl estándar de la Association of Official Agricultural Chemists (AOAC), 2001.11 (2005)/NTC 4657 (1999), al Laboratorio Certificado de Alta Complejidad de la Universidad de La Salle, en la ciudad de Bogotá.

Como fuente inorgánica se eligió el nitrato de sodio (NaNO₃), debido a que en diferentes investigaciones consultadas [23]-[25] se ha visto que la microalga C. vulgaris puede metabolizar este nutriente y lograr altas densidades celulares, a diferencia de otras fuentes, como los nitritos.

Como fuente orgánica se eligió el suero lácteo, por ser un subproducto con alta disponibilidad, pues cerca del 90 % [26] se obtiene de la elaboración de quesos y presenta alta relación costo-beneficio (costo: $1,16/g; beneficio: 7 % de nitrógeno teórico, relación 6,03). La harina de soya se eligió por ser de fácil manipulación y tener baja susceptibilidad a la contaminación, además de presentar la mejor relación costo-beneficio (7,04 % de nitrógeno y $1,05/g). Finalmente, se seleccionó la harina de sangre, porque a pesar de tener la más baja relación costo-beneficio (0,23) no se encontraron investigaciones anteriores con este subproducto como fuente de nutrientes para cultivos microalgales. Los datos de los precios de dichos residuos se obtuvieron consultando las respectivas empresas generadoras.

Para seleccionar la mejor fuente orgánica, se realizó la prueba de adaptación de la microalga C. vulgaris, cuyos resultados se ven en la tabla 1.

Tabla 1

T. 1

Con base en los resultados mostrados en la tabla 1, se evaluó la influencia de la concentración del suero lácteo, partiendo del mejor rango de crecimiento presentado en literatura [4]. Se muestran los promedios de tres réplicas en la figura 2.

Figura 2

Fig. 2

En la figura 3 se observan las curvas de crecimiento variando la concentración de NaNO₃ (1,0; 1,25 y 1,5 gL^-1). Son los promedios de tres réplicas.

Figura 3

Fig. 3

Se comparó el crecimiento con el suero lácteo, y con el NaNO₃, contra un medio control, sin fuente de nitrógeno adicional, a un volumen final de 3 L. Se partió de las concentraciones que dieron los mejores resultados para cada fuente. Las curvas promedio, de tres réplicas, se presentan en la figura 4.

Figura 4

Fig. 4

Se evaluó el peso seco total (PST). En la tabla 3 se muestran los resultados.

Tabla 3

T. 3

El método Kjeldahl estándar de la AOAC, realizado en el Laboratorio de Alta Complejidad de la Universidad de La Salle, en Bogotá, determinó un porcentaje de proteína bruta para el tratamiento enriquecido con suero lácteo del 55,63 %, siendo este el mayor entre los tratamientos evaluados. Para el medio control se obtuvo un 45,05 % y, por último, un valor del 39,54 % para el cultivo enriquecido con NaNO₃.

Lo observado permite sugerir que el enriquecimiento con el suero lácteo no ayuda a alcanzar mayores concentraciones celulares, sino que favorece la fracción proteica de esta biomasa, a diferencia de lo reportado en la literatura, que expresa que los cultivos heterotróficos tienen menor acumulación de proteínas [6]. No hay estudios sobre evaluaciones de la fracción de proteína de la microalga al adicionar suero lácteo como nutriente; sin embargo, este porcentaje es similar al obtenido en otros estudios, en los que se ha enriquecido el medio de cultivo con fuentes orgánicas, como humus de lombriz, el cual obtuvo una fracción proteica del 56,8 % [11].

El porcentaje obtenido en el medio control fue del 45,05 %, similar al de otra investigación [29], con un valor dek 44,56 % de proteína al evaluar la composición bioquímica de la microalga C. vulgaris cultivada autotróficamente.

El medio de cultivo autotrófico enriquecido con NaNO₃ obtuvo la menor cantidad de proteínas, con un 39,54 % en peso seco en este trabajo, e inferior a valores obtenidos en otras investigaciones, como un 44,3 % [6] y porcentajes cercanos al 46 % [25]. Finalmente, en otro estudio similar, el rango de rendimientos de proteínas estuvo entre el 34 % y el 60 % [30].