El nitrógeno, factor limitante del crecimiento microalgal, se emplea para la síntesis de proteínas. Encontrar fuentes económicas y no convencionales de nitrógeno para los cultivos puede favorecer el rendimiento y la viabilidad del proceso. En este proyecto, primero, se realizó una selección teórica de los potenciales residuos que se iban a evaluar; luego, se evaluó el crecimiento del cultivo, productividad de biomasa microalgal y rendimiento de proteína en cultivos de Chlorella vulgaris enriquecidos con fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico, suero lácteo y NaNO3, con fotoperiodos de 12 h de luz: 12 h de oscuridad a 20 ± 1 ºC, durante 7 días. Las mayores tasas de crecimiento del cultivo se dieron a concentraciones de 0,041 gL-1 de nitrógeno enriquecido para la fuente orgánica, con una productividad de biomasa de 0,07828 gL-1d-1. La mayor fracción proteica se obtuvo para el cultivo con suero lácteo: 55,63 % en biomasa seca. Se concluye que el enriquecimiento con esta fuente orgánica de nitrógeno y carbono permitió un incremento celular y de proteína.

Las microalgas son alternativas promisorias para fabricar diferentes metabolitos, como lípidos, proteínas y pigmentos. Los procesos mediados por microalgas son eficientes y sostenibles, por su capacidad de utilizar contaminantes, lo que permite la remediación del agua y el aire [1], mientras se cultiva biomasa, para extraer metabolitos [2].

De la composición bioquímica de la microalga Chlorella vulgaris se conoce que el contenido de proteína promedio está entre el 51 y el 58 % en peso seco, incluso porcentajes mayores según algunas investigaciones que han variado las condiciones de cultivo [3]. Además, contiene aminoácidos esenciales para el cuerpo humano y es fuente de proteína de alta calidad según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura [4]. La composición bioquímica de la biomasa microalgal depende de las condiciones específicas de cultivo. Para la elaboración de proteínas, por ejemplo, se deben controlar parámetros como luz, temperatura y nutrientes [5]. Dentro de la composición del medio de cultivo, el nitrógeno es un nutriente limitante del crecimiento, debido a que la microalga lo convierte en proteínas [6], [7], esenciales para su funcionamiento.

La mayoría de las microalgas puede usar distintas especies químicas como fuentes inorgánicas: nitratos (NO3-), nitritos (NO2-) o sales de amonio (NH4+) [8]. Se ha informado que para cultivos heterotróficos la fuente de nitrógeno de mayor asimilación por la microalga C. vulgaris es el nitrato de sodio [6].

También se han usado fuentes orgánicas, como la urea [9], al igual que residuos industriales de procesos, como los del ablandamiento del grano de soya, que contienen aminoácidos aprovechables [10] y permiten alcanzar altos valores de densidad celular.

Por otra parte, se ha evaluado el crecimiento celular de la microalga C. vulgaris en medios enriquecidos con compuestos orgánicos, como lixiviados de estiércol [11], humus de lombriz y excremento de caballo, en relación con fertilizantes tradicionales, y se ha concluido que las densidades celulares alcanzadas fueron menores respecto al medio enriquecido con un fertilizante complejo NPK [11]. De la evaluación del suero lácteo se obtuvieron 0,076 gL-1d-1 de biomasa seca con el cultivo enriquecido; mientras que el medio control produjo 0,05 gL-1d-1 [12].

Según tales resultados, en este trabajo se buscó enriquecer el medio de cultivo con residuos agrícolas o industriales como fuentes orgánicas, a efectos de producir proteínas a partir de C. vulgaris. Para ello, a partir de [13], inicialmente, se realizó una selección teórica de las fuentes orgánicas. Luego, se obtuvieron las curvas y las tasas intrínsecas de crecimiento para los cultivos. Por último, se cuantificó la proteína en la biomasa seca de los cultivos, con el fin de establecer no solo la fuente que generó mayor densidad celular, sino la de mayor acumulación de proteína, que permitirá reducir los costos en un proceso a escala industrial.

Se partió de un cultivo base de C. vulgaris al que se le añadió fertilizante foliar [14]. Luego se siguió la técnica aséptica descrita por Malajovich [15], y como fuente de luz se empleó una cinta LED roja (figura 1, icono 2) de 14,4 W, con longitud de onda 600-680 nm [15] y un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad [16], controladas con un temporizador Completel TS-WU3 (figura 1, icono 3). Para la agitación se usaron bombas de aire Shark RS-610 (figura 1, icono 4), con un caudal de 4 L/min, conectadas directamente a cada recipiente de vidrio de 250 mL (figura 1, icono 5), por medio de mangueras de 1/16 de plástico. El recipiente también tenía una manguera de salida, para desgasificar (figura 1, icono 6).

Los diferentes tipos de subproductos provenientes de procesos industriales o agrícolas se compararon mediante una matriz de selección, con los criterios de relación de porcentaje de nitrógeno a costo, susceptibilidad a contaminación y disponibilidad. El primer criterio se refiere a la cantidad de nitrógeno en porcentaje teórico de cada fuente que puede aportar al medio de cultivo [14], dividido entre el costo por gramo de cada una en el mercado.

Este criterio se evaluó definiendo tres rangos de relación: bajo, de 0 a 0,3; medio, de 0,3 a 5, y alto, mayor a 5. La susceptibilidad a la contaminación se tomó en cuenta, dado que no todas las fuentes tienen la misma carga de microrganismos, materia orgánica y contenido de agua; por ello, se evaluó este criterio para determinar si es necesario realizar algún pretratamiento a dichas fuentes. En la evaluación del criterio de disponibilidad se buscaron fuentes de fácil adquisición en Bogotá (zona de realización del ensayo experimental), para evitar costos adicionales de transporte y que no compitieran con la alimentación humana.

Después de seleccionar tres fuentes orgánicas potenciales para el cultivo, se determinaron las concentraciones de experimentación.

No se encontró información sobre el uso de la harina de sangre ni de la de soya; pero sí del suero de la leche [12]. En la literatura sobre el tema [12], [13], [17] se consultaron los valores de la proteína bruta en el suero lácteo, la harina de sangre y la harina de soya (7 %, 10 % y 7,04 %), y ya que esta es una medida indirecta de la cantidad de nitrógeno, con el factor mostrado en la ecuación 1 se realizaron las conversiones de proteína bruta a nitrógeno.

Ntotal = Proteína bruta / 6,25 (1)

Este factor se basa en la suposición de que aproximadamente un 16 % de nitrógeno está presente en la proteína promedio [18].

Para el seguimiento a los cultivos se utilizó el método de recuento celular en la cámara de Neubauer [16], [19] y se halló la concentración celular por medio de la ecuación 2.

= #𝐶é𝑙.𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗ 𝐹𝐷 ∗ 50.000 (2)

FD es el factor de dilución. Para evaluar la cinética de crecimiento, se usó la ecuación 3, según la cual el incremento celular por unidad de tiempo es proporcional al número de células en el cultivo, y la constante de proporcionalidad es la tasa de crecimiento (µ) [17], [19], [20].

dN/dt = µN (3)

Con las concentraciones celulares se graficaron las curvas de crecimiento, que, linealizadas, permitieron determinar las tasas intrínsecas de crecimiento de la microalga en cada medio, gracias a la ecuación 4.

Ln N = Ln No+ µt (4)

Donde N es el número de células al cabo del tiempo t y N o es el número inicial de células [21].

Los cultivos microalgales se enriquecieron [14] con la fuente orgánica e inorgánica de nitrógeno a concentraciones definidas previamente. Después de ello se compararon con un ensayo experimental de control, con fertilizante foliar. Los parámetros de evaluación fueron: peso seco, rendimiento de la biomasa, productividad volumétrica y fracción proteica. El volumen total de trabajo en los experimentos fue de 3 L.

Se evaluó la influencia de la concentración de suero lácteo y de la concentración del NaNO3, mediante análisis de varianza (Anova) de un factor, para determinar si afectaban significativamente la tasa intrínseca de crecimiento en los cultivos, con un nivel de significancia, α = 0,1.

Se empleó el protocolo basado en: métodos y herramientas analíticas en la evaluación de la biomasa microalgal [22]. Las muestras se secaron en un horno marca Nabertherm-TR120, variando su temperatura gradualmente hasta 50 °C durante 18 h para muestras de 50 mL. Después, se llevaron las muestras a un desecador por 3 h y se pesaron en una balanza analítica de 5 dígitos hasta peso constante.

Por último, se determinó el peso seco mediante la ecuación 5, y la productividad volumétrica, mediante la ecuación 6.

PST = (PSFM-PSF) / VF (5)

Donde PST es el peso seco total, PSFM y PSF son los pesos del filtro con muestra y del filtro sin muestra, respectivamente, y VF es el volumen de muestra filtrado.

Productividad = PST / Vc∙t (6)

Donde PST es el peso seco de la biomasa, Vc es el volumen total de cultivo y t es el tiempo de cultivo en días.

Previo al envío para análisis, la muestra se secó en un horno Challenger GH/DOR 120V/E, a 100 °C durante 12 h para muestras de 280 mL. Se dispuso de 0,53 g de biomasa seca de cada uno de los tratamientos para enviar a análisis de cuantificación de proteínas por el método Kjeldahl estándar de la Association of Official Agricultural Chemists (AOAC), 2001.11 (2005)/NTC 4657 (1999), al Laboratorio Certificado de Alta Complejidad de la Universidad de La Salle, en la ciudad de Bogotá.

Como fuente inorgánica se eligió el nitrato de sodio (NaNO3), debido a que en diferentes investigaciones consultadas [23]-[25] se ha visto que la microalga C. vulgaris puede metabolizar este nutriente y lograr altas densidades celulares, a diferencia de otras fuentes, como los nitritos.

Como fuente orgánica se eligió el suero lácteo, por ser un subproducto con alta disponibilidad, pues cerca del 90 % [26] se obtiene de la elaboración de quesos y presenta alta relación costo-beneficio (costo: $1,16/g; beneficio: 7 % de nitrógeno teórico, relación 6,03). La harina de soya se eligió por ser de fácil manipulación y tener baja susceptibilidad a la contaminación, además de presentar la mejor relación costo-beneficio (7,04 % de nitrógeno y $1,05/g). Finalmente, se seleccionó la harina de sangre, porque a pesar de tener la más baja relación costo-beneficio (0,23) no se encontraron investigaciones anteriores con este subproducto como fuente de nutrientes para cultivos microalgales. Los datos de los precios de dichos residuos se obtuvieron consultando las respectivas empresas generadoras.

Para seleccionar la mejor fuente orgánica, se realizó la prueba de adaptación de la microalga C. vulgaris, cuyos resultados se ven en la tabla 1.

Con base en los resultados mostrados en la tabla 1, se evaluó la influencia de la concentración del suero lácteo, partiendo del mejor rango de crecimiento presentado en literatura [4]. Se muestran los promedios de tres réplicas en la figura 2.

La dosificación a la cual la microalga C. vulgaris creció más rápido fue 5 mL de suero lácteo, correspondiente a una concentración de 0,041 gL-1 de enriquecimiento de nitrógeno.

En la figura 3 se observan las curvas de crecimiento variando la concentración de NaNO3 (1,0; 1,25 y 1,5 gL-1). Son los promedios de tres réplicas.

Las tasas de crecimiento resultantes fueron: µ = 0,4127 d-1, µ = 0,3366 d-1 y µ = 0,3794 d-1, respectivamente, muy cercanas entre sí. No obstante, para la concentración de 1 gL-1 de NaNO3, el factor de correlación es más cercano a uno, R2 = 0,9577, por lo cual se seleccionó para determinar la proteína. Por otro lado, se realizó el Anova de un factor indicando que a 0,05 de significancia, cualquiera de estas 3 concentraciones no representa un cambio significativo en la variable respuesta.

Se comparó el crecimiento con el suero lácteo, y con el NaNO3, contra un medio control, sin fuente de nitrógeno adicional, a un volumen final de 3 L. Se partió de las concentraciones que dieron los mejores resultados para cada fuente. Las curvas promedio, de tres réplicas, se presentan en la figura 4.

Según la figura 4, al enriquecer el medio de cultivo con una fuente de nitrógeno, aumentan las tasas de crecimiento promedio, respecto al medio control como se resume en la tabla 2. No obstante, la mayor correlación se da con la fuente inorgánica.

Entre las dos fuentes evaluadas, el medio enriquecido con suero lácteo fue el que presentó una mayor tasa de crecimiento.

Se evaluó el peso seco total (PST). En la tabla 3 se muestran los resultados.

El mayor rendimiento de biomasa seca se obtuvo en el tratamiento enriquecido con suero lácteo (54,80 %), seguido del tratamiento enriquecido con NaNO3 (33,89 %). Así, se confirmó que los cultivos heterotróficos, generalmente, presentan una mayor productividad de biomasa respecto a los autotróficos [6].

En la tabla 4 se muestran los resultados de la productividad de los cultivos.

El suero lácteo dio una productividad de 0,0783 gL-1d-1, muy superior a los otros tratamientos evaluados, mayor que el reportado por [12] (0,076 gL-1d-1) y mucho mayor a los resultados obtenidos por [27] (0,038 gL-1d-1). Por el contrario, la productividad con NaNO3 alcanzada en este trabajo, 0,0484 gL-1d-1, es inferior a otras referencias [6] y [28], aunque en este último el mejor resultado se consiguió con una mezcla con acetato de sodio como fuente de carbono orgánico.

El método Kjeldahl estándar de la AOAC, realizado en el Laboratorio de Alta Complejidad de la Universidad de La Salle, en Bogotá, determinó un porcentaje de proteína bruta para el tratamiento enriquecido con suero lácteo del 55,63 %, siendo este el mayor entre los tratamientos evaluados. Para el medio control se obtuvo un 45,05 % y, por último, un valor del 39,54 % para el cultivo enriquecido con NaNO3.

Lo observado permite sugerir que el enriquecimiento con el suero lácteo no ayuda a alcanzar mayores concentraciones celulares, sino que favorece la fracción proteica de esta biomasa, a diferencia de lo reportado en la literatura, que expresa que los cultivos heterotróficos tienen menor acumulación de proteínas [6]. No hay estudios sobre evaluaciones de la fracción de proteína de la microalga al adicionar suero lácteo como nutriente; sin embargo, este porcentaje es similar al obtenido en otros estudios, en los que se ha enriquecido el medio de cultivo con fuentes orgánicas, como humus de lombriz, el cual obtuvo una fracción proteica del 56,8 % [11].

El porcentaje obtenido en el medio control fue del 45,05 %, similar al de otra investigación [29], con un valor dek 44,56 % de proteína al evaluar la composición bioquímica de la microalga C. vulgaris cultivada autotróficamente.

El medio de cultivo autotrófico enriquecido con NaNO3 obtuvo la menor cantidad de proteínas, con un 39,54 % en peso seco en este trabajo, e inferior a valores obtenidos en otras investigaciones, como un 44,3 % [6] y porcentajes cercanos al 46 % [25]. Finalmente, en otro estudio similar, el rango de rendimientos de proteínas estuvo entre el 34 % y el 60 % [30].

Según las curvas de crecimiento para tres concentraciones de la fuente de nitrógeno inorgánica y cinco concentraciones para la fuente de nitrógeno orgánica seleccionada, las mejores velocidades específicas de crecimiento (µ) fueron: en la fuente inorgánica (NaNO3) a 1 gL-1, o un enriquecimiento de nitrógeno teórico de 0,044 gL-1, con un valor de µ = 0,365 d-1. Con la fuente orgánica la mejor dosificación fue 5 mL de suero lácteo, es decir, un enriquecimiento de nitrógeno teórico proporcionado al cultivo de 0,041 gL-1 con un valor de µ = 0,329 d-1.

La comparación entre la fuente orgánica e inorgánica de nitrógeno confirmó la mayor densidad celular en cultivos heterotróficos, es decir, en el cultivo enriquecido con suero lácteo. Se halló que la fuente con mayores productividades volumétricas y velocidades específicas de crecimiento fue la orgánica, con 0,078 gL-1d-1 de biomasa seca y un valor de µ = 0,241 d-1; por su parte, la fuente inorgánica dio una productividad de 0,048 gL-1d-1 de biomasa seca y velocidad, µ = 0,235 d-1.

El enriquecimiento de nitrógeno con fuentes orgánica e inorgánica de nitrógeno en los cultivos de C. vulgaris generó un incremento en el rendimiento de biomasa del 54,80 % y del 33,89 %, respectivamente, comparado con el medio control (17,92 %). El medio enriquecido con suero lácteo aumentó en 10 % el porcentaje de proteína, y mejoró tanto la productividad de biomasa como la acumulación de proteínas, en biomasa seca: 55,63 %.